De voorbereiding en de voorzorgsmaatregelen van de RNAextractie

Sterilisatie van pipetuiteinden en EP-buizen, enz.

1. Bereid zorgvuldig 0,1% (één duizendste) DEPC (hoogst giftige substantie) met gedeioniseerd water voor, gebruik het in een dampkap, en sla het bij 4°C vanaf licht op;

DEPC-het water is zuiver die water met DEPC wordt en door op hoge temperatuur en hoge druk wordt gesteriliseerd behandeld die. Getest vrij om van RN-ase, DNase en proteïnase te zijn.

2. Zet het pipetuiteinde en EP-buis in 0,1% DEPC, en zorg ervoor dat het pipetuiteinde en EP-de buis met 0,1% departement worden gevuld.

3. Bescherm tegen licht, laat tribune, 's nachts (12-24h)

4. De doos die het uiteinde en EP-buis bevatten te hoeven niet om in DEPC worden doorweekt. Na ruwweg het verwijderen van het DEPC-water in het uiteinde of EP-buis, pak het in omhoog en verpak omhoog het.

5. 121 graden van Celsius, 30min

6. 180 graden van Celsius, drogen voor verscheidene uren (minstens 3 uren)

Nota: a. draag latexhandschoenen en maskers wanneer het behandeling van DEPC! B, of zonder DEPC-sterilisatie, 130 ℃, 90min-autoclaaf (velen laboratoriasterilisatie op hoge temperatuur tweemaal)

De overwegingen van de RNAextractie

Twee belangrijke fenomenen van de isolatiemislukking van weefselrna

De RNAdegradatie en de residu's van onzuiverheden in weefsels, betreffende degradatie, eerst bekijken waarom RNA uit beschaafde cellen wordt gehaald die niet gemakkelijk wordt gedegradeerd. De bestaande reagentia allen van de RNAextractie bevatten componenten die snel RN-ase verbieden. Voeg lysate aan de beschaafde cellen toe, en meng het eenvoudig, kunnen alle cellen grondig met lysate worden gemengd, en de cellen lysed volledig. Nadat de cellen lysed, verbieden de actieve ingrediënten in lysate onmiddellijk intracellular RN-ase, zo blijft RNA intact. D.w.z., omdat de beschaafde cellen gemakkelijk en volledig met lysate toe worden gecontacteerd, wordt hun RNA niet gemakkelijk gedegradeerd; anderzijds, wordt RNA in het weefsel gemakkelijk gedegradeerd omdat de cellen in het weefsel niet gemakkelijk zijn lysate snel om te contacteren. wegens voldoende contact. Zo, het veronderstellen is er een manier om het weefsel in single cell te veranderen terwijl de verbiedende RNAactiviteit, het probleem van degradatie volledig zou kunnen worden opgelost.

Het vloeibare stikstofmalen is het meest efficiënt dergelijke methode. Nochtans, is de methode van het vloeibare stikstofmalen zeer lastig, vooral wanneer het aantal steekproeven groot is. Dit leidde tot het volgende beste ding: de homogenisator. De homogenisatormethode overweegt niet de kwestie van hoe de RN-aseactiviteit geremd alvorens de cellen met lysate _ gecontacteerd is, maar eerder bidt dat het tarief van weefselverstoring sneller is dan het tarief waaraan intracellular RN-ase RN degradeert.

Het effect van elektrische homogenisator is beter, en het effect van glashomogenisator is slecht, maar in het algemeen, kan de homogenisatormethode niet het degradatiefenomeen verhinderen. Daarom als de extractie wordt gedegradeerd, zou de originele elektrische homogenisator voor het malen met vloeibare stikstof moeten worden gebruikt; de originele glashomogenisator zou moeten in een elektrische homogenisator worden veranderd of direct met vloeibare stikstof worden gemalen. Het probleem is bijna uitvoerbare 100%. word vastbesloten.

Het probleem die van het onzuiverheidsresidu verdere experimenten beïnvloeden heeft diversere oorzaken dan degradatie, en de oplossingen zijn navenant verschillend. Samenvattend, als er degradatie of overblijvende onzuiverheden in het weefsel zijn, moet de de extractiemethode/reagens voor het specifieke experimentele materiaal worden geoptimaliseerd. U moet niet uw kostbare steekproeven voor optimalisering gebruiken: u kunt sommige kleine dieren zoals vissen/kip van de markt kopen, het overeenkomstige deel van het materiaal voor RNAextractie, en het andere deel voor eiwitextractie nemen - maal met mond, maag en darmenuittreksel.

Doelrna van gehaald RNA wordt gebruikt voor verschillende opvolgendeexperimenten, en zijn kwaliteitsvereisten zijn verschillend

cDNA vereist de bibliotheekbouw RNAintegriteit zonder residu's van de inhibitors van de enzymreactie; Noordelijk vereist hogere RNAintegriteit en lagere eisen ten aanzien van de inhibitorsresidu's van de enzymreactie; Rechts-PCR vereist te geen hoge RNAintegriteit, maar remt enzymreacties. De residuvereisten zijn strikt. De input bepaalt de output; telkens als het doel hoogste zuiverheidsrna te verkrijgen is, zal het de mensen en het geld kosten.

Inzameling/Opslag van Steekproeven

Calculeert het Beïnvloeden van Degradatie in nadat de steekproef het leven body/or het originele de groeimilieu verlaat, zullen de endogene enzymen in de steekproef beginnen RNA te degraderen, en het degradatietarief is verwant met de inhoud van endogene enzymen en temperatuur. Traditioneel, zijn er slechts twee manieren endogene enzymactiviteit volledig om te remmen: voeg lysate onmiddellijk toe en homogeniseer snel grondig en; besnoeiing in reepjes en onmiddellijk vorst in vloeibare stikstof. Beide benaderingen vereisen snelle verrichting. De laatstgenoemde is geschikt voor alle steekproeven, terwijl de eerstgenoemde voor weefsels met lage inhoud van cellen en endogene enzymen en gemakkelijker slechts geschikt is te homogeniseren. Specifiek, installatieweefsel, lever, zwezerik, alvleesklier, milt, hersenen, vet, spierweefsel, enz. zijn het best bevroren met vloeibare stikstof alvorens te werk te gaan.

Fragmentatie en homogenisatie van steekproeven

De factoren die Degradatie en de fragmentatie van de Opbrengststeekproef is beïnvloeden voor grondige homogenisatie, die voor volledige en volledige versie van RNA is. De cellen kunnen direct zonder wordt gebroken worden gehomogeniseerd. De weefsels kunnen slechts na wordt gebroken worden gehomogeniseerd. De gist en de bacteriën moeten met overeenkomstige enzymen worden gebroken alvorens zij kunnen worden gehomogeniseerd. De weefsels met lagere endogene enzym tevreden en gemakkelijkere homogenisatie kunnen in één keer in lysate door een homogenisator worden verpletterd en worden gehomogeniseerd; installatieweefsel, lever, zwezerik, alvleesklier, milt, hersenen, vet, spierweefsel en andere steekproeven, zijn zij of hoog in endogene enzymen of zijn niet gemakkelijk gehomogeniseerd, zodat moeten de de weefselverstoring en homogenisatie afzonderlijk worden uitgevoerd. De betrouwbaarste en productiefste methode van fragmentatie maalt met vloeibare stikstof, en de betrouwbaarste methode van homogenisatie is het gebruik van een elektrische homogenisator. Een speciale nota over malen met vloeibare stikstof: de steekproef moet niet tijdens het volledige malenprocédé worden ontdooid, aangezien de endogene enzymen eerder zullen functioneren wanneer bevroren.

Keus van lysate

Beïnvloedend het gemak van verrichting en de factoren van overblijvende endogene onzuiverheden kunnen de algemeen gebruikte lysis oplossingen de activiteit van RN-ase bijna remmen. Daarom moet het belangrijke punt van het kiezen van een lysis oplossing in combinatie met de reinigingsmethode overwegen. Er is één uitzondering: de steekproeven met hoge endogene enzyminhoud worden geadviseerd om een lysate te gebruiken die fenol bevatten om de capaciteit te verhogen om endogene enzymen buiten werking te stellen.

Keus van reinigingsmethode

De factoren die overblijvende endogene onzuiverheden beïnvloeden, extractiesnelheid voor schone steekproeven zoals cellen, bevredigende resultaten kunnen met bijna om het even welke dichtbije reinigingsmethode worden verkregen. Maar voor veel andere steekproeven, vooral die met hoge niveaus van onzuiverheden zoals installaties, lever, bacteriën, enz., die geschikte reiniging kiezen is een methode essentieel. De methode van de kolom centrifugaalreiniging heeft een snelle extractiesnelheid en kan onzuiverheden effectief verwijderen die de verdere enzymatische reactie van RNA beïnvloeden, maar het is duur (Foregene kan rendabele uitrustingen, meer detailsklik hier aanbieden); het gebruiken van economische en klassieke reinigingsmethodes, zoals LiCl precipitatie, kan bevredigende resultaten ook verkrijgen, maar de verrichtingstijd is lang.

„Drie Disciplines en Acht Aandacht“ voor RNAextractie

Discipline 1: Maak een eind aan de verontreiniging van exogene enzymen.

Nota 1: Strikt slijtagemaskers en handschoenen.

Nota 2: De centrifugebuizen, de Uiteindehoofden, de pipetstaven, de elektroforesetanks, en de experimentele banken betrokken bij het experiment zouden grondig moeten worden weggedaan.

Nota 3: De reagentia/de oplossingen betrokken bij het experiment, vooral water, moeten RN-ase-Vrij zijn.

Discipline 2: Blokkeer de activiteit van endogene enzymen

Nota 4: Kies een aangewezen homogenisatiemethode.

Nota 5: Kies een aangewezen lysate.

Nota 6: Controleer het basisbedrag van de steekproef.

Discipline 3: Verduidelijk uw extractiedoel

Nota 7: Met om het even welk lysatesysteem die het maximumbasisbedrag van steekproef naderen, scherp daalt het tarief van het extractiesucces.

Nota 8: Het enige economische criterium voor succesvolle RNAextractie is een succes in verdere experimenten, niet opbrengst.

Top 10 Bronnen van RN-aseverontreiniging

1. De vingers zijn de eerste bron van exogene enzymen, zodat moeten de handschoenen vaak worden gedragen en worden vervangen. Bovendien moeten de maskers ook worden gedragen, omdat de ademhaling ook een belangrijke bron van enzymen is. Een extra voordeel om een handschoenmasker te dragen moet de experimentator beschermen.

2. Pipetuiteinden, centrifugebuizen, pipetten – RN-ase kan niet door alleen sterilisatie worden buiten werking gesteld, zodat zouden de pipetuiteinden en de centrifugebuizen met DEPC moeten worden behandeld, zelfs als zij als behandelde DEPC duidelijk zijn. Het is best om een pipet voor speciale doeleinden te gebruiken, het met een 75%-alcohol katoenen bal afvegen v3o3or gebruik, vooral de staaf; bovendien ben zeker om een hoofdvlekkenmiddel niet te gebruiken.

3. Het water/de buffer moet van RN-aseverontreiniging vrij zijn.

4. Minstens zou de testlijst schoon met 75%-alcohol katoenen ballen moeten worden afgeveegd.

• Endogene RN-ase Alle weefsels bevat endogene enzymen, zodat is het diepvriezen van weefsels met vloeibare stikstof de beste manier om degradatie te verminderen. De vloeibare stikstof opslag/het malen methode is inderdaad ongelegen, maar het is de enige manier voor weefsels met hoge niveaus van endogene enzymen.

6. De producten van de RNAextractie van RNAsteekproeven kunnen sporen van RN-aseverontreiniging bevatten.

7. De de Plasmideextractie van de plasmideextractie gebruikt vaak RN-ase om RNA te degraderen, en overblijvende RN-ase zou moeten met Proteïnase K worden verteerd en door PCI worden gehaald.

8. De RNAopslag zelfs als het bij lage temperatuur wordt opgeslagen zal, spoorbedragen van RN-ase RNAdegradatie veroorzaken. De beste oplossing voor behoud op lange termijn van RNA is een zoute/alcoholopschorting, omdat de alcohol al enzymatische activiteit bij lage temperaturen remt.

9. Wanneer de kationen (Ca, Mg) deze ionen bevatten, zal het verwarmen bij 80C 5 minuten veroorzaken dat RNA wordt gespleten, zodat als RNA moet worden verwarmd, moet de behoudsoplossing een chelating agent (1mM Natriumcitraat, pH 6,4) bevatten.

10. De enzymen in verdere experimenten worden gebruikt kunnen door RN-ase worden vervuild die.

10 uiteinden voor RNAextractie

1: Verhinder snel RN-aseactiviteit. De steekproeven zijn snel bevroren na inzameling, en RN-ase wordt buiten werking gesteld door snelle verrichting tijdens lysis.

2: Kies een aangewezen extractiemethode voor weefsel met hoge ribozymeinhoud, en het vetweefsel is best om de methode te gebruiken die fenol bevatten.

3: De voorspellingskwaliteit vereist Noordelijk, cDNA vereist de bibliotheekbouw zeer integer, en rechts-PCR en RPA (de analyse van de Ribonucleasebescherming) vereisen zeer integer niet. Rechts-PCR vereist hoge zuiverheid (de residu's van de enzyminhibitor).

4: De grondige homogenisatie is de sleutel aan het verbeteren van opbrengst en het verminderen van degradatie.

5: Controleer de integriteit van de opsporing van de RNAelektroforese, 28S: 18S = 2: 1 is een volledig teken, 1: 1 is ook aanvaardbaar voor de meeste experimenten.

6: De verwijdering van DNA voor rechts-PCR, serieanalyse het is best om Dnase I te gebruiken om DNA te verwijderen.

7: Verminder de verontreiniging van exogene enzymen - de enzymen kunnen niet uit de buitenkant worden ingevoerd.

8: Wanneer het concentreren van laag-concentratie nucleic zuur, zou een mede-precipitatiereagens moeten worden toegevoegd. Maar om het mede-neerslagmiddel te verhinderen bevattend enzymen en DNA-verontreiniging.

9: Los grondig RNA indien nodig, hitte bij 65C op 5 minuten.

geschikte opslagmethode

Het kan bij – 20C voor een korte tijd, en bij – 80C lange tijd worden opgeslagen. De eerste stap in het verbeteren van RNAopbrengsten is te realiseren dat de RNAinhoud van verschillende steekproeven zeer varieert. Hoge overvloed (2-4ug/mg) zoals lever, alvleesklier, hart, middelgrote overvloed (0.05-2ug/mg) zoals hersenen, embryo, nier, long, zwezerik, eierstok, lage overvloed (<0>

1: Lyse cellen om RN vrij te geven – als RNA niet wordt vrijgegeven, zal de opbrengst worden verminderd. De elektrische homogenisatie werkt dan beter andere homogenisatiemethodes, maar kan ook met andere methodes moeten worden gecombineerd, zoals vloeibare stikstof het fijnstampen, enzymatische spijsvertering (Lypozyme/Lyticase)

2: Optimalisering van de extractiemethode. De grootste problemen met op fenol-gebaseerde methodes zijn onvolledige gelaagdheid en gedeeltelijk RNAverlies (de bovendrijvende substantie kan niet volledig worden verwijderd). De onvolledige gelaagdheid is toe te schrijven aan hoog nucleic zuur en eiwitgehalte, dat kunnen worden opgelost door de gebruikte hoeveelheid lysate te verhogen of de hoeveelheid steekproef te verminderen. Een stap van chloroformextractie werd toegevoegd aan het vetweefsel. Het RNAverlies kan worden verminderd door achter-te pompen of door de organische die laag te verwijderen door centrifugeren wordt gevolgd. Het grootste probleem met kolom op centrifugeren-gebaseerde methodes is bovenmatige steekproef.

Klassieke Extractieuiteinden

1. Fenolreiniging: Voeg een gelijk volume van 1:1fenol/Chloroform en mengeling krachtig 1-2 minuten toe. Centrifugeer bij hoge snelheid 2 minuten. Verwijder zorgvuldig de bovendrijvende substantie (80-90%). Word nooit aan de middenlaag. Een gelijk volume van de reactieoplossing kan aan Fenol/Chloroform en verwijderd bovendrijvend worden toegevoegd. Twee supernatants kunnen samen voor nucleic zure precipitatie worden gemengd om de opbrengst te verbeteren. Niet ben te zacht wanneer zich het mengen, en probeer niet om al bovendrijvende substantie te verwijderen.

2. Het wassen met ethylalcohol 70-80%: Tijdens was, moet het nucleic zuur worden opgeschort om ervoor te zorgen dat het overblijvende zout wordt gereinigd. Tegelijkertijd, onmiddellijk na het gieten van de ethylalcohol, centrifugeer gedurende enkele seconden bij hoge snelheid, en verwijder dan de overblijvende ethylalcohol met een pipet. Los na het betekenen bij kamertemperatuur 5-10 minuten op.

11. Extractie van speciale organisaties

1. Vezelig weefsel: De sleutel tot RNAextractie van vezelig weefsel zoals hart/skeletachtige spier moet het weefsel volledig onderbreken. Deze weefsels hebben lage celdichtheid, zodat is de hoeveelheid RNA per eenheidsgewicht van weefsel laag, en het is best om zoveel mogelijk basisbedrag te gebruiken. Ben zeker om het weefsel in het bevriezen de omstandigheden grondig te malen.

2. Weefsels met hoogte - eiwit/vetgehalte: de hersenen/het plantaardige vetgehalte zijn hoog. Na PCI-extractie, bevat de bovendrijvende substantie witte vlokjes. De bovendrijvende substantie moet met chloroform worden opnieuw geëxtraheerd.

3. Weefsels met hoge nucleic zuur/ribozymeinhoud: de milt/de zwezerik hebben hoge nucleic zuur en ribozymeinhoud. Het malende die weefsel in het bevriezen de omstandigheden door snelle homogenisatie worden gevolgd kan effectief buiten werking stellen ribozymes. Nochtans, als lysate (wegens hoge nucleic zure inhoud) te kleverig is, zal de PCI-extractie niet kunnen effectief in lagen verdelen; het toevoegen van meer lysate kan deze kwestie oplossen. De veelvoudige PCI-extracties kunnen meer overblijvende DNA verwijderen. Als een wit precipitaat zich onmiddellijk na het toevoegen van alcohol vormt, wijst het DNA-op verontreiniging. De re-extractie met zuurrijke PCI na ontbinding kan DNA-verontreiniging verwijderen.

4. Installatieweefsel: Plant het weefsel is complexer dan dierlijk weefsel. Over het algemeen, worden de installaties gemalen in de vloeibare stikstofomstandigheden, zodat is de RNAdegradatie door endogene enzymen ongewoon. Als het degradatieprobleem niet wordt opgelost, wordt het bijna zeker veroorzaakt door onzuiverheden in de steekproef. De onzuiverheden in vele installaties zullen leiden tot residu's, en de reden voor residu's is vaak omdat deze onzuiverheden sommige gelijkenissen met RNA hebben: u stort en ik stort, en u adsorbeert en ik adsorbeer. Deze kenmerken bepalen dat zij zeer sterke enzyminhibitors zijn.

Momenteel, kunnen de commerciële reagentia van de RNAextractie aan bijna alle dierlijke weefsels met kleine aanpassingen worden aangepast, maar er zijn weinig commerciële reagentia van de RNAextractie die voor de meeste installatieweefsels geschikt kunnen zijn. Gelukkig, kan Foregene speciale de extractieuitrustingen van installatierna verstrekken, hebben wij de Isolatieuitrusting van Installatie Totale RNA, de Isolatieuitrusting van Installatie Totale RNA plus. De laatstgenoemde wordt speciaal ontworpen voor installaties met hoge polysaccharide en polyphenol inhoud. Voor RNAextractie, koppel van laboratoriumgebruikers is terug bijzonder goed.

12. Het effect die van steekproef en de bevroren steekproef bevriezen ontdooien kan groter zijn, en het moet worden gesneden alvorens wordt gebruikt voor RNAextractie. De steekproeven neigen om (misschien gedeeltelijk) tijdens knipsel te smelten. De bevroren steekproeven kunnen vóór RNAextractie moeten worden gewogen, en het ontdooien zal absoluut tijdens dit proces voorkomen. Soms, komt het ontdooien van de steekproef ook tijdens het procédé van het vloeibare stikstofmalen voor; of de bevroren steekproef wordt direct toegevoegd aan lysate zonder vloeibare stikstofmalen, en het ontdooien zal absoluut vóór de volledige homogenisatie voorkomen. De experimenten hebben aangetoond dat het bevroren weefsel naar voren meer gebogen is aan RNAdegradatie tijdens het ontdooien dan vers weefsel. De waarschijnlijke reden: Het freeze-thaw proces onderbreekt structuren binnen de cel, die het maken voor endogene enzymen gemakkelijker om in direct contact met RNA te komen.

13. Het oordeel van RNAkwaliteit gewoonlijk, wordt elektroforese gebruikt om de integriteit van RNA te beoordelen, en A260/A280 wordt gebruikt om de zuiverheid van RNA te beoordelen. In theorie, heeft intact RNA een verhouding van 28S: 18S = benadrukken het 2.7:1, en de meeste gegevens de verhouding van 28S: 18S = 2:1. Het feit is dat bijna niets van RNA uit steekproeven buiten cellen wordt gehaald in een 2:1verhouding is (dit werd verkregen gebruikend Agilent Bioanalyzer die).

De elektroforeseresultaten van RNA worden beïnvloed door vele factoren, met inbegrip van secundaire structuur, elektroforesevoorwaarden, steekproeflading, graad van verzadiging door EB, enz. Gebruik inheemse elektroforese om RNA en de Teller van gebruiksdna als controle te ontdekken. Als 28S bij 2kb en 18S bij 0.9kb, en 28S duidelijk zijn: 18S > kan 1, de integriteit aan de vereisten van de meeste verdere experimenten voldoen.

A260/A280 is een indicator die heel wat verwarring heeft veroorzaakt. Eerst en vooral, is het noodzakelijk om de originele betekenis van deze indicator voor nucleic zuren te verduidelijken: zuiver zijn RNA, A260/280 = ongeveer 2,0. Zuiver RNA is omdat en A260/A280 = 2 het ‚effect‘ zijn. Nu gebruikt iedereen A260/A280 als because, denkend dat „als A260/A280 = 2, dan RNA“ zuiver zijn, wat natuurlijk tot verwarring leidt.

Als u interessant bent, kunt u een kleine reagens toevoegen die vaak in extractie, zoals fenol, guanidine isothiocyanate, PIN, enz., aan uw RNAsteekproef, wordt gebruikt en dan de A260/A280-verhouding meet. De werkelijkheid is dat veel van de reagentia voor RNAextractie worden gebruikt, evenals vele onzuiverheden in de steekproef, rond A260 en A280 absorberen, beïnvloedend A260/A280 die.

De leerzaamste benadering momenteel is RNAsteekproeven in de 200-300 NM waaier af te tasten. De kromme van zuiver RNA heeft de volgende kenmerken: de kromme is vlot, zijn A230 en A260 twee verbuigingspunten, is A300 dicht aan 0, A260/A280 = rond 2,0, en A260/A230 = rond 2,0. Als de aftastengegevens niet beschikbaar zijn, moet de A260/A230-verhouding ook worden bepaald, aangezien deze verhouding gevoeliger is voor uitstel van alle onzuiverheden die de enzymatische reactie beïnvloeden. Houd rekening met de lineaire waaier van het apparaat (0.1-0.5 voor A260).

Er zijn twee andere nuttige fenomenen: de verhouding zal ongeveer lager 0,3 zijn wanneer A260/A280 in water wordt gemeten; terwijl de verhouding in 10 mm-EDTA is ongeveer 0,2 hoger dan dat gemeten in 1 mm-EDTA mat.