Rechts-QPCR EasyTM Taqman Één Stap Hoofdmengeling rechts-PCR In real time

Rechts -rechts-qPCR EasyTM (Één Stap) - Taqman

Voor PCR die in real time cDNA, gezuiverde DNA gebruiken

Productinleiding

Producten van de Foregene realiseren de Éénfasige Gemakkelijke reeks rechts-PCR de geïntegreerde reactie van RNA op double-stranded DNA, d.w.z., omgekeerde transcriptie en PCR de versterking wordt voltooid in dezelfde buis van de reactiecentrifuge en hetzelfde reactiesysteem, dus de experimentele vereenvoudigde stappen, het experimentele geoptimaliseerde plan, en de experimentele betere efficiency.

Rechts -rechts-qPCR EasyTM (Één Stap) - Taqman die de Polymerase van DNA van Foregene HotStar Taq gebruiken, het geoptimaliseerde systeem van Taqman qPCR kan kwantitatieve opsporing Rechts -rechts-qPCR In real time van de malplaatjes van spoorrna snel en specifiek uitvoeren.

Vervoer en opslagvoorwaarden

• Vervoersvoorwaarden: Het gehele proces wordt vervoerd in een ijsdoos bij lage temperatuur om ervoor te zorgen dat de uitrusting in een staat van is <4>
• Opslagvoorwaarden: De uitrusting wordt opgeslagen bij -20℃. Sla het product in een constante temperatuurijskast bij -20℃ onmiddellijk na ontvangstbewijs op. Als de opslagvoorwaarden aangewezen zijn, zal het product geen prestaties tijdens de geldigheidsperiode van één jaar degraderen.

De informatie van de uitrustingscomponent

• 2× Rechts -rechts-qPCR EasyTM mengeling-Taqman: Foregene Omgekeerde Transcriptase, RN-aseinhibitor, de Polymerase van DNA van Foregene HotStar Taq, optimaliseerde verhouding van dNTPs, Mg2+, stabilisator, versterker, en optimizer.
• ROX-Verwijzingskleurstof: Over het algemeen gebruikt op PCR thermische cyclers In real time van bedrijven zoals ABI, Stratagene, enz., die het verschil onder PCR buizen aan te passen door PCR de fouten van de steekproeflading wordt veroorzaakt. De concentratie van ROX-Verwijzingskleurstof door verschillende instrumenten wordt vereist is verschillend, en de gebruiker kan het volgens de geadviseerde concentratie van het instrument toevoegen dat.

Voorzorgsmaatregelen:

u de Reagentia zouden het herhaalde bevriezen en het ontdooien moeten vermijden, anders zullen de prestaties van de reagentia verminderen of zullen ongeldig worden.

u de reagentia in de uitrusting zouden moeten tegen licht worden beschermd en bij -20°C. worden opgeslagen.

u het wordt geadviseerd om verse die steekproefextractie of malplaatjerna te gebruiken bij -80°C wordt opgeslagen (RNA zou het herhaalde bevriezen en het ontdooien moeten vermijden).

u om RN-aseverontreiniging te vermijden, te voeren gelieve het experiment in de RN-ase-Vrije ruimte uit; de gebruikte pipetuiteinden en PCR de buizen moeten RN-ase-Vrij zijn; en slijtage beschikbare handschoenen en maskers.

u Deze uitrusting met specifieke inleidingen voor experimenten moet worden gebruikt. Gelieve te selecteren de specifieke inleidingen voor het gen dat volgens de behoeften van het experiment moet worden vergroot.

u v3o3or gebruik, zette 2× Rechts -rechts-qPCR EasyTM mengeling-Taqman op ijs om zich volledig te smelten flick en v3o3or gebruik mengen goed; de voorbereiding van het systeem zou op een ijsbad moeten worden in werking gesteld om de prestaties van de uitrusting te verbeteren en PCR versterking te verhogen.

De concentratie van malplaatjerna

Rechts -rechts-qPCR EasyTM (Één Stap) - Taqman: (1 pg-100 ng totaal RNAμl systeem)/20.

Verrichtingsgids

A: Voorbereiding van materialen en reagentia

• Bereid het voorbereide RNAmalplaatje (het wordt geadviseerd om van de RNAisolatie van Foregene te gebruiken de Totale uitrustingen van de de Uitrustingsreeks om RNA te halen en te zuiveren), specifieke inleidingen (10 μM) en verwante verbruiksgoederen en instrumenten voor.

Nota: Verzeker gelieve de integriteit van RNA en te proberen die RNA te gebruiken uit verse steekproeven wordt gehaald.

• Gezette 2× Rechts -rechts-qPCR EasyTM mengeling-Taqman, RN-ase-Vrije de Verwijzingskleurstof van ddH2O, en van 20× ROX (indien nodig) op ijs om het te laten natuurlijk, en flick de buismuur smelten zich tot gebruik te mengen.

B: Rechts -rechts-qPCR systeemvoorbereiding

2× Rechts -rechts-qPCR EasyTM mengeling-Taqman is geschikt en snel te gebruiken, en vermijdt verontreiniging tijdens verrichting en experimentele die fouten door veelvoudige voorbereidingen van het reactiesysteem zoveel mogelijk wordt veroorzaakt. Wanneer het gebruiken, slechts voegt de helft van het volume van het reactiesysteem (bijvoorbeeld, als het reactiesysteem 20 μl is, neem 10 de oplossing van μl 2× Rechts -rechts-qPCR EasyTM mengeling-Taqman), passend bedrag RNAmalplaatje en specifieke inleidingen toe, en voegt RN-ase-Vrije ddH2O toe om het volume omhoog te maken. De specifieke Rechts -rechts-qPCR voorbereiding van het reactiesysteem kan naar Lijst 1 hieronder verwijzen.

Lijst 1: Rechts -rechts-qPCR systeemvoorbereiding

Nota: De voorwaartse Inleiding en de Omgekeerde Inleiding zijn specifieke inleidingen voor het doelgen. Het qPCRsysteem kan volgens experimentele behoeften en PCR model worden aangepast. Voor de definitieve concentratie van de meeste inleidingen, adviseren wij 400nM. Gelieve te passen de dosering van de specifieke inleiding en de Sonde volgens de voorbereide concentratie volgens onze geadviseerde definitieve concentratie aan. Voor qPCR met 50μl-systeem, gelieve te verwijzen naar het 20μl-systeem om de hoeveelheid reagentia proportioneel aan te passen.

1*: Kies de aangewezen definitieve concentratie van ROX-Verwijzingskleurstof volgens verschillende kwantitatieve PCR instrumenten. De optimale concentratie van ROX-Verwijzingskleurstof voor wordt gemeenschappelijke kwantitatieve PCR machines getoond in de volgende lijst:

C: Rechts -rechts-qPCR reactiesysteem het plaatsen

• Na zacht het voorbereiden van het systeem Rechts -rechts-qPCR met betrekking tot de bovengenoemde lijst, mengeling (u kunt een zacht pipette pipetuiteinde gebruiken; u kunt zich ook op een vortexer mengen en kort centrifugeren om de vloeistof te verzamelen op de buismuur of de buis GLB wordt verspreid, en op ijsdoos te plaatsen die voor later gebruik).
• Verwijs naar de Rechts -rechts-qPCR montages van het reactieprogramma (Lijst 2) om de temperatuur en de tijd van de reactie te plaatsen.

Nota: om de activiteit van 2× Rechts -rechts-qPCR EasyTM mengeling-Taqman te verzekeren en zijn versterkingsefficiency te verbeteren, is het best om het Rechts -rechts-qPCR reactiesysteem na vestiging voor te bereiden het PCR instrumentenprogramma, zodat het reactieprogramma kan onmiddellijk zijn ingegaan nadat de systeemvoorbereiding wordt voltooid.

• om het beste qPCReffect te krijgen, gradiënt kan PCR worden gebruikt om de reactievoorwaarden voor verschillende malplaatjes en verschillende inleidingen te optimaliseren.

Nota: De waaier van de uitbreidingstemperatuur van de Polymerase van DNA van Foregene Hotstar Taq in deze uitrusting wordt verstrekt die is: 60-72℃, en de beste uitbreidingstemperatuur is 72℃.

Het volgende is een voorbeeld van Rechts -rechts-qPCR reactievoorwaarden. Het wordt geadviseerd om een methode in twee stappen voor PCR reactie te gebruiken. Wanneer de malplaatjeconcentratie te laag is om niet-specifieke versterking te veroorzaken, leidt de lage inleidingstm waarde tot lage versterkingsefficiency of de slechte herhaalbaarheid van de versterkingskromme, enz., wordt het geadviseerd om de methode in drie stappen voor PCR reactie te proberen. Verwijs naar Lijst 2-1 (methode in twee stappen) en dien 2-2 (methode in drie stappen) voor het plaatsen van Rechts -rechts-qPCR reactievoorwaarden in.

Lijst 2-1: Rechts -rechts-qPCR reactieprogramma het plaatsen (methode in twee stappen)

Lijst 2-2: Rechts -rechts-qPCR reactieprogramma het plaatsen (methode in drie stappen)

1*: De omgekeerde transcriptietijd kan volgens experimentele behoeften worden aangepast. De algemene endogene genen zoals β-Actin vergen slechts 10 minuten; om specifieke uitgedrukte genen te ontdekken, kan de omgekeerde transcriptietijd geschikt worden uitgebreid zoals nodig.

2*: Plaats een specifieke tijd volgens de lengte van het vergrote doelfragment. De versterkingssnelheid van de Polymerase van DNA van Foregene HotStar Taq is 2kb/min

Nota: PCR de reactievoorwaarden variëren afhankelijk van de structurele voorwaarden van het malplaatje, de inleidingen, enz. Voor RNAmalplaatjes met complexe secundaire structuren, wordt het geadviseerd om 42℃ voor de eerste stap van omgekeerde transcriptie te gebruiken. In de specifieke verrichting, is het noodzakelijk om de optimale reactievoorwaarden volgens de specifieke voorwaarden zoals de grootte van het doelfragment te ontwerpen, de basisopeenvolging van het vergrote fragment en de GC inhoud en de lengte van de inleiding, met inbegrip van onthardende temperatuur, uitbreidingstijd, enz.

Het werkstroom: